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Identification des bactéries difficiles Peter ROHNER Sommaire Tuberculose Première partie : la tuberculose Histoire de la tuberculose 15'000 av. J-C
: M. bovis à l'origine; domestication des bovins et passage
à l'homme. Première
tentative d'explication :
une tumeur d'origine héréditaire. Modes de transmission et d'infection 1913 : P. Chaussé confirme que les BK survivent pendant des années dans les crachats secs ou sur les vêtements. Infection : des gouttelettes
contenant des BK pénètrent dans les alvéoles pulmonaires. Les bacilles
sont le plus souvent inactivés par les macrophages. Chez 5 à 10% des individus, les BK passent des ganglions dans la circulation è origine des multiples foyers. 80% des infections guérissent spontanément. Tuberculose : littérature et musique La tuberculose joue un rôle central dans La Dame aux Camélias (1848) d' Alexandre Dumas fils et dans l'opéra de Giuseppe Verdi, La Traviata (1853). Parmi les tuberculeux célèbres, on citera John Keats ( 1795 - 1821), Robert Stevenson ( 1850 - 1894), George Orwell (1903 - 1950), Franz Kafka (1883 - 1924) et Thomas Mann (1875 à 1955) qui a décrit l'univers des sanatoriums dans La montagne magique (1924). Biologie de la tuberculose
Agent : Mycobacterium
tuberculosis Bacille
de Koch (BK) Réservoir : humains et bovins (M. bovis) Transmission
:
interhumaine,
aérosol Incubation
:
des mois, des années.
Epidémiologie
Selon les estimations de
l'OMS : Cependant, l'incidence de la maladie varie fortement
selon les pays (figure 1). Figure
1. Incidence de la tuberculose
dans le monde en 1995. En Suisse, comme dans tous les pays occidentaux,
l'arrivée des antibiotiques a entraîné une forte baisse de la
mortalité tandis la morbidité ne connaît qu'un lent déclin (figure 2).
Figure
2. Evolution
de l'incidence de la tuberculose en Suisse. Si les tuberculoses pulmonaires représentent la grande
majorité des cas, d'autres localisations ne sont pas à exclure (figure
3). Figure
3. Distribution des localisations des foyers tuberculeux en 1978. La
tuberculose au laboratoire
Figure
4. Répartition des
prélèvements analysés. Les tests de laboratoire doivent être réalisés dans des
zones contrôlées et les échantillons doivent être maniplués avec
précaution.
Les micro-organismes sont classés en 4 groupes de risque,
selon les dangers qu'ils peuvent faire encourir au personnel de
laboratoire. Mycobacterium
tuberculosis et Mycobacterium
bovis sont classés dans le groupe de risque 3. A partir de cette
classification, on a établi 4 niveaux de sécurité pour les laboratoires
(tableau 1).
Tableau 1.-
Niveaux de sécurité des laboratoires. La
procédure choisie pour identifier les mycobactéries au HUG est résumée par
la figure 7. Après décontamination à la N-acétyl L-cystéine (NALC), les
échantillons sont mis en culture sur deux milieux solides :1 tube de milieu Coletsos et 1 tube de milieu de
Stonebrink. Ces cultures ne donneront des colonies qu'après 4 semaines.
Fig 7 : Procédure utilisée à l'hôpital de Genève pour la détection des
mycobactéries en 2002. Le premier système de culture
automatique en milieu liquide a été le BACTEC ® 460 TB (Becton Dickinson)
qui est basé sur une analyse de respirométrie radiométrique qui permet
d'apprécier la croissance des mycobactéries en
mesurant la quantité de 14CO2
libérée par le métabolisme de l'acide palmitique marqué au 14C
présent dans le milieu de culture Middelbrook) 7H12 B (BACTEC 12B). L'appareil Bactec®
permet de mesurer la quantité de 14CO2
dans l'atmosphère gazeuse du flacon et de l'exprimer selon une
graduation appelée GI (Growth Index) allant de 0 (absence de 14CO2)
à 999 correspondant à la quantité maximale de croissance décelable
par l'automate.
Le même fabricant a ensuite
développé une technique non radioactive en milieu liquide qui fournit des
résultats après 2 semaines : le MGIT (Mycobacteria Growth Indicator
Tube - Becton Dickinson).
Cette méthode utilise un milieu 7H9
contenant un sel de ruthénium. Cette susbstance émet une
fluorescence d'autant plus vive que la pression partielle d'oxygène
est plus faible. Le métabolisme microbien provoque une déplétion en
oxygène et entraîne l'apparition d'une fluorescence dont l'intensité
est proportionnelle au niveau de réduction du milieu. La lecture des
tubes s'effectue manuellement : le tube MGIT doit être retiré du
support et comparé aux tubes témoins. On recherche les tubes MGIT émettant
une fluorescence qui se caractérise par une couleur
orange vif dans le fond du tube et une réflexion orange sur le ménisque
de la surface. Si la fluorescence du tube MGIT se rapproche de celle
du tube témoin positif, la culture est positive. Si elle se rapproche
de celle du tube témoin négatif, la culture est négative. La croissance peut aussi être détectée
par la présence d'une turbidité homogène ou non, de petits grains
ou de flocons dans le milieu de culture. La
combinaison des 2 technologies a fourni l'automate que nous utilisons en
routine, le BACTEC MGIT 960. Le BACTEC
9000MB est basé sur le même principe, avec une moindre capacité de
chargement.
Autre système automatique, le
MB/BacT (Organon Teknika) utilise une méthode
de détection qui en permanence évalue dans le flacon de culture, l'évolution
de la croissance microbienne en mesurant grâce à un indicateur coloré
convenable, la quantité de CO2 élaboré. Le système de lecture
complété d'un équipement informatique sophistiqué compare les
mesures obtenues à un système algorithmique de référence et déclenche
le signal de positivité quand la variation des différents paramètres
est suffisante.
On ajoutera enfin à cette énumération l'ESP
Culture System II de Difco.
On trouve également des méthodes
manuelles utilisant des milieux de culture mixtes tels que le BBL
SEPTI-CHEK*AFB (Becton
Dickinson). Il combine un milieu liquide 7H9
(flacon) avec une lame pour le repiquage et la différenciation provisoire
des mycobactéries cultivées dans le flacon. La lame montée sur le
flacon contient trois milieux solides spécifiques :
De nombreuses études ont permis de comparer les performances de
ces différents systèmes (tableaux 2, 3 et 4, figures 8 et 9). Système positif
62 [21 (3.5%)]
Tableau
No. (%)
de cultures positives par système avec:
Tableau
Temps
(jours)
moyen de détection
Tableau
Fig 8 : Temps de détection du BACTEC 12, du MGIT et des milieux solides. Source
: Rohner P. EJCMID 2000.
Fig 9 : Temps de détection du BACTEC 460, du MB/BacT et des milieux solides.
Source : Rohner P. JCM 1997:3127. Toutes ces études nous ont
conduit à choisir le
système BACTEC 960 avec milieu MGIT 7ml
dont les pricipaux avantages sont les suivants :
Sensibilité
comparable au milieu BACTEC 12B
Contamination
acceptable
Rapidité
de détection comparable au BACTEC 460
Détection
sans substrat radioactif Degré
d’automatisation
Incubateur
intégré
Encombrement réduit Inoculation
sans aiguilles.
Si la culture reste très utilisée pour le diagnostic de
la tuberculose, la biologie moléculaire a permis des avancées
considérables. La figure 10 compare les principes de deux méthodes
d'amplification génique commerciales.
Fig 10 : Principe de l'amplification génique par PCR (Amplicor, Roche) et par Ligase Chain
Reaction (LCx®, Abbott) Plusieurs études ont permis d'évaluer les
performances de ces tests rapides (tableaux 5, 6 et 7). Culture M. tuberculosis Tableau 5.- Comparaison
sur 2001 échantillons des performances du test LCx et de
la culture pour la détection de M. tuberculosis (Genève et Zurich,
1997). Ces données
permettent d'établir les performances du test LCx : Tableau
6.- Performances
des tests rapides pour la détection du Complexe M. tuberculosis (MTD :
TMA, transcription-mediated amplification, Gen-Probe ; PCR : Amplicor,
Roche ; LCx : Ligase Chain Reaction, Abbott). Tableau
La figure 11 montre que la tuberculose n'est de
loin pas la seule mycobactérie détectée au laboratoire de bactériologie de
Genève. Le tableau 8 présente quelques unes des espèces qui peuvent être
isolées.
Fig 11 : Cultures de mycobactéries positives à Genève de 1989 à 2001 (Cmtbc
: Complexe M. tuberculosis ; MOTT : mycobacteria other than tuberculosis,
autres mycobactéries).
Tableau 8.-
Classification des Mycobactéries
selon Runyon.
Deuxième partie : la lèpre Histoire
de la lèpre Dans
la Bible,
on déclare
les lépreux "impurs". Biologie
de la lèpre Agent
:
Mycobacterium
leprae (Bacille
de Hansen). Habitat
: strictement humain. Transmission
:
interhumaine,
principalement sécrétions nasales et sécrétions oropharyngées ou lésions
cutanées ulcérées (lèpre lépromateuse). Incubation
: 2
à 5 ans. Prévalence
de la lèpre
Les
tableaux 9 et 10 fournissent quleques chiffres-clé sur l'incidence de la
lèpre. Tableau 9.- Evolution de
l'incidence de la lèpre. Tableau 10.- Epidémiologie
de la lèpre dans les pays d'endémie. Source :
Bull OMS 1995.
Cas
clinique de lèpre à Genève Patiente
née le 26/10/1926, hospitalisée HUG le 26/6/1995 Présentation
à l'admission : plaques érythémateuses, bien délimitées 1 à 4 cm au dos et aux
jambes, macules dépigmentées Diagnostic
: Lèpre
type borderline. Traitement
: Dapsone,
rifampicine, prednisone. Aspects
cliniques Tableau 11.- Classification
selon l'OMS des incapacité dues à la lèpre (Bull
OMS 1995).
Diagnostic
de la lèpre Biopsie
de la peau : histologie, coloration de Ziehl Neelsen modifiée. Aucune
culture a été obtenue sur milieu artificiel ou en culture cellulaire. Tests
cutanés (intradermoréaction à la lépromine) : pas de valeur
diagnostique mais permettent la classification. Traitement
de la lèpre (uniquement
en association) Tableau 12.- Principaux
agents thérapeutiques actifs sur le bacille de Hansen.
Conclusion Grâce
à la polychimiothérapie, 6,7
Mio de malades ont été guéris dont 2,5 Mio d'anciens cas et 4,2 Mio de
nouveaux cas. Troisième
partie : les légionelloses
Histoire de
la légionellose En 1976, à
Philadelphie, lors d'un congrès de l'American Legion, plus de 200 participants
sont frappés de pneumonie foudroyante, dont 40 cas mortels. En 1977,
description d'une nouvelle espèce bactérienne responsable de cette
"maladie des légionnaires": Legionella pneumophila. Espèces de
Legionella On dénombre
41 souches de léginnelles, dont la moitié sont pathogènes pour l'homme
et 18 connues pour provoquer des pneumonies (tableau ). L. micdadei
1943
L. Micdadei
Importance
de la légionellose La légionellose est
responsable de 2-15% des
pneumonies communautaires en Europe et aux États-Unis (Murder
RR et al. Semin Respir Infect 1989;4:32). Les légionelles comptent parmi
les s 3
agents infectieux les plus fréquents de pneumonies communautaires (Stout
JE et al. NEJM 1992;326:151). La
légionellose cause 35-50% des
pneumonies chez les transplantés (Chow
J and Yu VL. Sem Resp Infect 1998;13:132). Taux de mortalité :
5-25% (Maston BJ et al.
Arch Intern Med 1994;154:2417). La
légionellose en Suisse Déclaration
au médecin cantonal et à l‘OFSP Recherche
du réservoir Surveillance
des cas liés au voyage : http://www.ewgli.org
Fig 12
: La légionellose en
Suisse : évolution de l'incidence entre 1988 et 1994 (n = 174). Source : Office
Fédéral de la Santé Publique " Légionelles et Légionelloses"
1999.
Fig
13 : La légionellose en
Suisse : répartition des cas déclarés entre 1995 et 1998 (n = 174). Source :
Office Fédéral de la Santé Publique " Légionelles et
Légionelloses" 1999.
Réservoirs
de Legionella L‘eau
potable représente un réservoir important : Stout
JE et al. NEJM 1992;326:151. L'aspiration
est le
mode de transmission principal : Blatt
SP et al. Am J Med 1993;95:16; Venezia
RA et al. Infect Control Hosp Epidemiol 1994;15:529. 6% (0-22%) des
maisons sont contaminées : Stout
JE et al. Epidemiol Infect 1992;109:49. Facteurs de
risque Tabagisme,
COPD (maladie pulmonaire obstructive chronique) Manifestations
cliniques Incubation :
3-10 jours. - Pneumonie Autres
présentations Examens radiologiques Les symptomes cliniques précèdent les signes radiologiques. Habituellement, on constate à la radiographie un infiltrat alvéolaire unilatéral qui progresse très rapidement pour devenir bilatéral. Un épanchement pleural est observé dans 30 % des cas (figure 14). Dans les cas graves, on peut observer des images pseudo tumorales. Les radiographies ne sont ni totalement atypiques, ni spécifiques (Tan et al. CHEST 2000;117:398). On notera qu'en cas de guérison, les
anomalies radiologiques peuvent persister plusieurs mois.
Diagnostic au laboratoire Les principales méthodes de diagnostic in vitro et leurs performances sont rassemblées dans le tableau 13.
Tableau 12.- Principales méthodes de mises en évidence des légionelles au laboratoire. * Culture indépendante de la qualité de l'expectoration. † Filtration, reste positive pendant des semaines. Le dosage de l'antigène urinaire utilisé à l'Hôpital de Genève n'est pas uniquement spécifique pour Lp1, mais pour tous les sérotypes de L. pneumophila. L. pneumophila peut parfois être mise en évidence par la coloration de Gram dans les prélèvements cliniques (figure 15). Les colorations de Dieterle et de Gimenez peuvent être utilisées pour metrre en évidence les légionelles dans les tissus.
La culture est largement utilisée et confirmée par immunofluorescence (figure 16).
Options thérapeutiques Les antibiotiques utilisables figurent dans le tableau 13. Un retard dans l'instauration du traitement a un impact négatif sur le pronostic (Heath CH et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996;15:286-90). La durée de traitement est normalement de 2 semaines, de 3 semaines chez les immunosupprimés. Avec l'azythromycine, 5 à 7 jours suffisent.L'érythromycine a constitué le traitement de choix lors des premières épidémies mais est aujourd'hui peu prescrit en raison de ses effets secondaires sur le tractus gastro-intestinal et ses interactions avec les enzymes hépatiques. L'azythromycine s'accumule dans les cellules et possède un bon pouvoir de pénétration dans le tissu pulmonaire. La rifampicine est administrée en association avec un macrolide ou une fluoroquinolone dans les cas graves. Les fluoroquinolones constituent le traitement de choix chez les transplantés, en raison de l'absence de risque d'interactions au niveau du foie. La tétracycline a été utilisée lors de l'épidémie historique de Pittsburgh, mais la doxicycline a la même action.
Tableau 1 3.- Antibiotiques actifs sur les légionelles.Prévention Qualité du
système sanitaire. Eradication? „Superheat and flush" : coûteux.Chlorination : toxique. Ionisation (cuivre et argent) : efficacité à prouver. Irradiation UV : action localisée. Révision du système sanitaire : coûteux. Conclusions Legionella:
un pathogène important dans la pneumonie. Quatrième partie : Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae Pouvoir pathogène chez l'homme C.
pneumoniae 50% de la population > 20 ans possèdent des anticorps et cette proportion passe à 80% chez les patients agés. M.
pneumoniae Espèces C.
pneumoniae M.
pneumoniae Diagnostic au laboratoire C.
pneumoniae M.
pneumoniae Agglutinine froide : fixation des IgM aux hématies et agglutination à faible température malgré un anticoagulant, détectable dans 50% infections sévères. Sérologie : la fixation du complément détecte les IgG et IgM spécifiques. Une augmentation du titre de 4 fois est indicative d’une infection. PCR : de nombreux tests PCR sont décrits dans la littérature, pas de tests commercialisés standardisés disponibles. PCR quantitative (Taqman) au Laboratoire Central de Bactériologie de l'Hôpital de Genève Echantillons
pouvant être testés : Extraction
de l'ADN : C.
pneumoniae : M.
pneumoniae : Volume réactionnel : 20µl (5 µl d ’ADN extrait) Contrôles
positifs: Contrôles
d ’inhibition : ADN plasmidique avec le fragment d ’amplification
clôné : Cinquième partie : B. pertussis Morphologie : en plus de la capsule et des pili, on trouve sur les souches virulentes une hémagglutinine filamenteuse qui permet l'adhésion sur les cellules de l'épithélium cilié de la trachée. Culture : lente et délicate à une température optimale de 35°C sans CO2, avec humidité. Le milieu classique de Bordet-Gengou est actuellement remplacé par un milieu au charbon de bois et extraits de levure, enrichi ou non par 5% de sang défibriné (cheval ou mouton) et additionné de céfalexine pour le rendre sélectif. Les colonies apparaissent en 2 à 4 jours. En isolement frais elles sont en charbon de bois et extraits de levure, enrichi ou non par 5% de sang défibriné (cheval ou mouton) et additionné de céfalexine pour le rendre sélectif. Les colonies apparaissent en 2 à 4 jours. En isolement frais elles sont en phase I : lisses (S) ou muqueuses (M), très petites, brillantes, grises = aspect en "goutte de mercure" et hémolytiques. Très vite, lors des repiquages, elles passent en phase II, III puis IV, devenant de plus en plus plates et rugueuses en perdant leur virulence.Pouvoir
pathogène : B.
pertussis est l'agent de la coqueluche, maladie infectieuse et contagieuse
strictement humaine. Atteint le plus souvent les nourrissons (chez
lesquels l'infection peut être mortelle) et les enfants de moins de 5
ans, elle devient plus rare par la suite.
Epidémiologie : en Europe, l'incidence de la coqueluche a beaucoup baissé grâce à la vaccination. Elle est en augmentation aux Etats-Unis et en Australie où la vaccination tend à être abandonnée. Traitement : prophylactique, par vaccination dès le 3e mois de la vie et curatif par érythromycine et sédatifs de la toux. Diagnostic au laboratoire : la recherche de B. pertussis et B. parapertussis doit être réalisée le plus tôt possible (pendant la phase catarrhale si possible). Sécrétions naso-pharyngées ou écouvillon naso-pharyngé, sécrétions bronchiques. Tous les autres prélèvements sont médiocres. L'amplification génique (PCR) est devenue la méthode de choix. Cultures sont toujours possibles (milieu de charbon de bois et extraits de levure) mais sont moins sensibles que la PCR. Identification
: Malgré la diminution considérable de la coqueluche par la vaccination des nourrissons (>95%), Bordetella pertussis (BP) continue à circuler chez les enfants plus grands et les adultes. Nous rapportons ici les leçons suggérées par une mini-épidémie de coqueluche dans un foyer d'accueil genevois en juillet 2001.2 bébés (1 mois, non vacciné et 5 mois,1 seul vaccin) vivant dans un foyer de 29 personnes (16 adultes, 13 enfants) ont été hospitalisés le même jour pour toux et état fébrile. Une PCR est revenue positive pour BP dans les sécrétions naso-pharyngées. Deux semaines plus tard, un troisième bébé (8 mois, 2 vaccins) présente une coqueluche, motivant un dépistage par PCR sur frottis naso-pharyngé de tous les membres du foyer. Les PCR sont revenues positives chez 2 adultes (la maman du bébé de 5 mois et une jeune fille de 19 ans sans enfant) et chez une fillette de 2 ans (3 vaccins seulement), tous asymptomatiques (suivi de 40 jours). Après traitement préventif (clarithromycine pendant 2 semaines) de tous les membres du foyer, aucun cas supplémentaire n’est survenu. Conclusion : cette mini-épidémie, favorisée par les contacts proches (mères et enfants dans une chambre commune, célibataires en chambres individuelles, 2 repas communs par jour), illustre la persistance de la circulation de BP, sa contagiosité, le risque que fait courir tout retard de vaccination des nourrissons (2/3 insuffisamment vaccinés) et l’utilité d’une prévention antibiotique en cas de contact proche (personnes sous le même toit). |
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